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Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 3625 (2023) Citare questo articolo

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La ricerca basata sui biochip si sta attualmente evolvendo verso una base tridimensionale e su larga scala simile al microambiente in vivo. Per l'imaging dal vivo a lungo termine e ad alta risoluzione in questi campioni, la microscopia non lineare in grado di ottenere immagini senza etichetta e multiscala sta diventando sempre più importante. La combinazione con l'imaging con contrasto non distruttivo sarà utile per individuare efficacemente le regioni di interesse (ROI) in campioni di grandi dimensioni e di conseguenza ridurre al minimo il fotodanneggiamento. In questo studio, una microscopia a coerenza ottica fototermica (OCM) senza etichetta funge da nuovo approccio per individuare la ROI desiderata all'interno di campioni biologici che sono oggetto di indagine mediante microscopia multifotone (MPM). La debole perturbazione fototermica nel campione da parte del laser MPM con potenza ridotta è stata rilevata sulle particelle fototermiche endogene all'interno della ROI utilizzando l'OCM fototermico a fase differenziata altamente sensibile (PD-PT). Monitorando la variazione temporale del segnale di risposta fototermica dell'OCM PD-PT, l'hotspot generato all'interno del campione focalizzato dal laser MPM è stato localizzato sulla ROI. In combinazione con il movimento automatizzato del campione sull'asse x-y, il piano focale dell'MPM può essere efficacemente spostato nella porzione desiderata di un campione volumetrico per l'imaging MPM mirato ad alta risoluzione. Abbiamo dimostrato la fattibilità del metodo proposto nella microscopia di generazione di seconda armonica utilizzando due campioni fantasma e un campione biologico, un insetto fisso su vetrino da microscopio, con dimensioni di 4 mm di larghezza, 4 mm di lunghezza e 1 mm di spessore.

La microscopia multifotone (MPM) consente analisi ad alta risoluzione in vari campi di ricerca biologica. Negli ultimi anni, l'uso dell'MPM ha continuato ad acquisire interesse nell'imaging biomedico, in particolare nelle aree dell'imaging di neuroni profondi in vivo e vivi in ​​piccoli animali1,2,3,4,5, della diagnosi precoce dei tumori e della sua caratterizzazione6,7, 8,9, rete vascolare e imaging di organoidi nel suo microambiente in bio-chip10,11,12. Sono stati adottati molti approcci per aumentare la profondità dell'immagine, un campo visivo più ampio (FOV) e ridurre il tempo di scansione volumetrica adottando fluorofori appropriati13, ottica adattiva14, meccanismi multi-fascio e multi-focali15,16, oltre ad altre modifiche simili nella configurazione ottica che ha fornito variazioni dei sistemi di imaging MPM adottabili in base alle esigenze di imaging e agli scenari applicativi 5,16,17,18,19,20,21.

Il fotodanneggiamento e il fotosbiancamento sono fattori critici da considerare nell'imaging multifotone. L'illuminazione prolungata accompagnata dall'elevata potenza del laser necessaria per l'imaging multifotone senza etichetta, esiste un fotomeccanismo di danno tissutale che determina una maggiore fluorescenza che causa la morte cellulare, ampiamente definita fotodanneggiamento 22,23,24. Per evitare il verificarsi di fotodanneggiamento nelle cellule viventi, è necessario prestare attenzione per garantire che i parametri di imaging siano ben al di sotto della soglia del fotodanneggiamento come intensità di picco, frequenza di ripetizione e tempi di esposizione prolungati (dimora)24. La maggior parte di questi parametri possono essere controllati dai sistemi di sorgente e di rilevamento. Diversi gruppi di ricerca hanno studiato e proposto vari approcci per sopprimere gli effetti del fotosbiancamento e del fotodanneggiamento. Il metodo più semplice e maggiormente adottato è quello di ridurre la potenza illuminante totale di una sorgente luminosa4,25,26. Tuttavia, questo, a sua volta, riduce la sensibilità complessiva del sistema a causa del ridotto rapporto segnale/rumore. Approcci alternativi segnalati per mitigare questo effetto implicano un metodo di esposizione alla luce controllata che controlla spazialmente la luce esposta sul campione, l'uso di un divisore di impulsi passivo che ridistribuisce l'impulso laser di illuminazione in sottoimpulsi con uguali energie e una scansione ottica veloce meccanismo che riduce il fotodanneggiamento controllando l'illuminazione e la raccolta delle emissioni dai campioni27,28,29,30. Inoltre, utilizzando il metodo di illuminazione a foglio luminoso, solo il piano focale dell'obiettivo di rilevamento viene effettivamente illuminato31. Sebbene questi metodi siano utili per ridurre gli effetti del fotodanneggiamento e del fotosbiancamento, è necessaria un'illuminazione ad alta potenza a lungo termine durante la ricerca della regione di interesse (ROI) in campioni di grandi dimensioni con FOV piccoli e tempi di scansione volumetrica lunghi, con conseguente fotodanneggiamento e fotosbiancamento.